四環(huán)凍干機—生物制品和生物組織凍干技術(shù)（九）

理想的角膜保存方法要滿(mǎn)足技術(shù)簡(jiǎn)單、最大限度地保持角膜組織的活性、保持生理狀態(tài)下角膜厚度和結構、有利于手術(shù)操作等要求?，F有的角膜保存技術(shù)中，除了最有代表性的4℃濕房短期保存法外，還有受者血清保存法、器官培養保存法、甘油冷凍保存法、深低溫冷凍保存法和無(wú)水氯化鈣干燥保存法，這些方法都沒(méi)能滿(mǎn)足上述理想保存方法的要求。角膜冷凍真空干燥的目的是保持其活性，便于較長(cháng)時(shí)間的貯存，使需求者能及時(shí)得到活性角膜，以便再植。

 5.5.1 眼角膜的凍干工藝流程                  

凍干角膜保持活性的關(guān)鍵是凍干工藝，角膜的凍干工藝是一個(gè)復雜的過(guò)程，如圖5-12所示。影響凍干效果的因素很多，如保護劑的配制、角膜的冷平衡、梯度降溫、凍干室內壓力變化、溫度變化，凍干角膜復水等。東北大學(xué)的王德喜對角膜的凍干進(jìn)行了系列研究。研究中使用的是中國醫科大學(xué)臨床醫院動(dòng)物室提供的大耳白家兔，體重為2～3kg。

 5.5.2 眼角膜凍結過(guò)程中的冷平衡            

角膜在梯度降溫過(guò)程中，要經(jīng)受-150℃以下的低溫損傷，在干燥過(guò)程中，要經(jīng)受干燥應力的損傷，在沒(méi)有保護劑保護情況下，經(jīng)歷如此損傷，角膜細胞很難保持活性。合理的選擇和配制保護劑對角膜的保存至關(guān)重要。實(shí)驗研究表明角膜由蔗糖、二甲基亞砜(DMSO)、20%安普萊士（人血白蛋白）作為保護劑，凍干效果良好。

為了防止角膜在凍結過(guò)程中損傷，還要對角膜進(jìn)行冷平衡處理。冷平衡保護劑的具體配比見(jiàn)表5-12。具體操作過(guò)程：將無(wú)菌的角膜片先放入1號液，移入4℃冰箱冷平衡10min，然后用無(wú)菌鑷子夾住鞏膜邊，將其移人2號液平衡10min，依次在3號液、4號液中各平衡10min。冷平衡工藝如圖5-13所示。在冷平衡過(guò)程中，保護劑中的DMSO通過(guò)角膜的細胞膜進(jìn)入到細胞中，置換出其中部分水分，在達到動(dòng)態(tài)平衡前，保護劑中DMSO濃度要高于細胞中DMSO濃度。角膜依次在不同濃度的保護劑中進(jìn)行冷平衡，這樣角膜中的水分就會(huì )不停地與保護劑中的DMSO進(jìn)行置換，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的傳質(zhì)，細胞中的水分將大量減少。由于細胞內水分溢出速度與DMSO的濃度有關(guān)，為防止細胞內水分溢出速度過(guò)快造成細胞的損傷，使角膜細胞有個(gè)適應過(guò)程，角膜冷平衡采取逐步遞增DMSO濃度進(jìn)行平衡。冷平衡處理后兔角膜內皮細胞經(jīng)聯(lián)合染色檢測，結果與新鮮角膜無(wú)區別，說(shuō)明冷平衡對角膜內皮細胞的活性無(wú)損傷，該冷平衡工藝可行。

待角膜在4號液平衡結束后，立即取出放入磨口玻璃瓶里，在降溫儀中進(jìn)行梯度降溫。梯度降溫目的是使細胞內的溶液凍結成玻璃態(tài)，以使角膜迅速越過(guò)對細胞凍傷最嚴重溫度區（-30～-60℃）時(shí)，細胞不受傷害。采用兩步法進(jìn)行梯度降溫，第一步角膜距液氮面9cm，停留l0min，使角膜內部溫度穩定在-16～-20℃范圍內，此階段角膜的降溫速率為2～2.4℃/min;第二步角膜距液氮面1.5cm，停留10min，使角膜內部溫度穩定在-130～-150℃范圍內，此階段角膜的降溫速率為11～14℃/min。慢速降溫時(shí)，細胞外的水易凍結成冰，電解質(zhì)濃度升高，細胞內的水滲出細胞外，使細胞暴露在高濃度的溶質(zhì)中，導致細胞膜蛋白復合體的破壞和膜的分解，造成溶質(zhì)損傷?？焖俳禍貢r(shí)，細胞內的水來(lái)不及滲出便結成冰，細胞內外同時(shí)有冰晶形成，容易刺破細胞造成機械損傷。這樣必須快速慢速相結合，方可達到目的。由于冷平衡時(shí)，二甲基亞砜已經(jīng)將細胞內的水分多數置換出去，在緩慢降溫時(shí)，細胞內的溶質(zhì)易形成玻璃態(tài)，可以避免溶質(zhì)損傷。故可以先慢速降溫，然后快速降溫。兩步法降溫中，第一步慢速冷凍，將角膜溫度慢速降至-20℃，可以避免過(guò)快冷凍時(shí)角膜內冰晶形成所造成的損傷和過(guò)慢冷凍時(shí)細胞置于高濃度溶液下時(shí)間過(guò)長(cháng)所造成的溶液損傷。第二步快速冷凍，角膜以很快的降溫速率降至-130℃以下，細胞內未凍溶液實(shí)現了非晶態(tài)固化，使細胞少受或不受損傷。